Medlemstidning för Svensk Förening för Diabetologi

Typ 1 diabetes mellitus - En immunsjukdom i obalans?


Av Ola Winqvist, Uppsala

Inledning
Vårt immunsystem är mycket kompetent att förhindra invasion utav kroppen ifrån bakterier och virus och det skyddar oss ständigt emot utvecklingen utav cancer celler. Priset vi får betala för detta skydd är att immunsystemet kan överreagera emot proteiner i omgivningen med allergi som följd eller att tolerans emot kroppens egna proteiner förloras såsom ses vid autoimmuna sjukdomar som tex multipel scleros, reumatoid artrit och insulin beroende typ 1 diabetes mellitus (IDDM).

Autoimmuna sjukdomar som grupp betraktat är en folksjukdom. Det har uppskattats att mellan 5-10% av befolkningen lider av en autoimmun sjukdom. Det finns sålunda ett behov av att förstå mekanismerna bakom regleringen utav immunsystemet med möjligheter att på ett specifikt sätt kunna modulera dess egenskaper så att olika typer av sjukdomar kan behandlas unikt med på ett molekylärt plan förutsägbara nödvändiga komponenter.

Autoantigen vid Addison’s sjukdom
Jag började intressera mig för autoimmuna sjukdomar under mitt avhandlingsarbete hos professor Anders Karlsson och professor Olle Kämpe vid endokrin sektionen på Akademiska sjukhuset i Uppsala där jag studerade uppkomstmekanismerna bakom autoimmun binjurebarksinsufficiens, Addison’s sjukdom.

Studierna resulterade i att vi kunde identifiera autoantigenet vid Addison’s sjukdom som ett av nyckelenzymerna i kortisolsyntesen, 21-hydroxylas. 21-hydroxylas enzymet är unikt uttryckt i binjurebarken och en autoimmun aktivering av B och T celler riktade mot 21-hydroxylas resulterar i en celldestruktion av de kortisol producerande binjurebarkscellerna. På motsvarande sätt sker _-cells destruktionen vid IDDM där autoreaktivitet mot bla autoantigenet glutamat dekarboxylas (GAD) föreligger.


Aktivering av T- hjälparceller.
Endocyterat protein degraderas utav den antigen presterande cellen (APC) och peptid fragment presenteras i fickan på klass II molekylen för T-cells receptom på en Th-hjälpar cell (Th). För att en Th cellen skall bli aktiverad krävs en andra signal och den uppkommer genom interaktion mellan kostimulatoriska molekyler på APC och receptorer på Th-cellen. Utfallet av aktivering beror på typ av av given kostinulering

Andra grupper har sedemera utvecklat assays för att påvisa autoantikroppar mot 21-hydroxylas och flera assays finns nu kommerciellt. 21-hydroxylas autoantikroppar kan påvisas i serum från subkliniska Addison patienter och förekomst av 21-hydroxylas autoantikroppar är en mycket stark prediktor för utveckling av sjukdom. Studier av stora material av patienter med IDDM, utan känd klinisk binjurebarksinsufficiens, visar att 1.5-2.5% av IDDM patienter har 21-hydroxylas autoantikroppar och ligger därmed i riskzonen för att utveckla Addison’s sjukdom.

Vissa förespråkare ibland amerikanska diabetologer rekomenderar regelbunden screening av IDDM patienter för förekomst av subklinisk Addison’s sjukdom med 21-hydroxylas autoantikroppar.


Antigen processning och klass II presentation
Många organ specifika autoimmuna sjukdomar såsom IDDM och Addison’s sjukdom har väldigt stark koppling till förekomst av vissa klass II tranplantationsantigener. För att lära mig mer om klass II tranplantationsantigener har jag varit 3 år hos professor Per Peterson på Scripps (RW Johnson), La Jolla, Kalifornien där jag studerat klass II antigen presentation och aktivering av klass II beroende T-hjälpar celler (Th).

Klass II transplantationsantigen finns på ytan av antigenpresenterande celler (APC) och presenterar peptid fragment, 12-18 amino syror långa för Th celler (Figur 1). Den antigen presenterande cellen kan vara en professionell APC tex en makrofag, en dendritisk cell, en B lymfocyt, eller det kan vara en cell som har uppreglerat klass II pga _-interferon produktion såsom ses i _-cellerna i pankreas vid diabetes.

För att en Th cell skall bli aktiverad och bli en effektor cell behövs dock ytterliggare kommunikation emellan APC och Th cell, sk kostimulering. Den aktiverade Th cellen förmedlar sedan hjälp till B-lymfocyter och till T-cytotoxiska (Tc) celler via cytokiner. Kostimulering kan modulera vilken typ av cytokiner som kommer att utsöndras. Th1 celler utsöndrar ffa _-interferon (IFN-_) och interleukin-2 (IL-2) vilket stimulerar Tc celler och ses vid autoimmuna destruktiva
sjukdomar emedan Th2 celler utsöndrar cytokinerna IL-4, IL-5 och IL-10 vilket leder till
antikroppsproduktionen vid tex allergi (Figur 2).

Manipulation
Vid mitt arbete på Scripps genmanipulerade jag Drosophila melanogaster celler, bananflugeceller, celler som är helt immunologiskt inerta till att bli antigen presenterande celler. Genom att införa klass II och diverse olika kostimulatoriska molekyler erhölls konstgjorda APC med önskvärda karakteristika och möjliggjorde en systematisk genomgång utav krav för Th cells aktivering. Bananflugeceller som transfekterats endast med klass II presenterar rätt peptid för renade specifika Th celler men Th cellerna blir inte aktiverade.

Detta bekräftar två signals teorin, dvs både interaktion emellan klass II peptid komplexet och T cells receptorn (TCR) och signalering via kostimulatoriska molekyler krävs för Th cell aktivering. Den viktigaste upptäckten var dock att stimulering av Th celler med olika kombinationer av kostimulatoriska molekyler uttryckta på transfekterade bananflugeceller gav upphov till produktion av olika cytokinprofiler. Med andra ord här finns ett verktyg som kan användas för att modulera Th celler till att bli Th1 effektor celler med ffa IFN-_ produktion och Tc aktivering som följd eller en annan kombination ger upphov till Th2 cytokiner och stimulering till antikroppsbildning.

NOD-mus
Vid autoimmun sjukdom verkar Th celler ha en central roll for sjukdomsutvecklingen. I en experimentell djur modell för IDDM, NOD musen, visar man att möss som utvecklar diabetes har Th celler som producerar cytokinen IFN-_ sk. Th1 respons. För att utvärdera flugceller som APC så har vi använt oss utav en T cells receptor transgen mus (DO11) som känner igen och aktiveras utav peptid ifrån ovalbumin om den presenteras utav mus klass II H2-Ad i närvaro utav kostimulering.

Flugceller som transfekterats med H2-Ad och antingen den kostimulatoriska molekylen B7.1 eller B7.2 gav mycket god proliferativ response utav naiva DO10 Th celler. Aktivering utav naiva CD4+ Th celler med tex ICAM-1 tillsammans med klass II och B7 molekyler ger utveckling utav Th1 IFN-_ producerande celler. Systemet medför därför att Th cellen kan aktiveras på ett förutbestämbart sätt så att Th1 eller Th2 cytokin producerande celler kan erhållas.

Utvärdering pågår i en transgen mus modell utav autoimmun diabetes, där membran bundet ovalbumin uttrycks under rått insulin promotorn som autoantigen i pankreas. Preliminära data visar att överföring av DO11 Th celler som blivit aktiverade av ovalbumin presenterat utav flugceller uttryckandes H2-Ad , B7, ICAM-1 utbildas till att producera Th1 cytokiner och ger upphov till diabetes utveckling i den ovalbumin transgena mottagar musen. Lymfocyt infiltrat erhålls i Langerhans öar och klinisk diabetes blir manifest efter 7-14 dagar efter transfer utav aktiverade Th1 celler.

När andra kombinationer utav molekyler uttrycks på den antigen presenterande flugcellen tex H2-Ad ensamt eller kombinationen H2-Ad, ICAM-1 ger transfer av de aktiverade DO11 Th cellerna inte upphov till sjukdom troligtvis pga av att Th celler utav Th2 typ har erhållits då dessa celler utsöndrar ffa IL-4 och IL-10. Dessa experimenten visar att Th1 celler är involverade i utvecklingen av organ specifik autoimmun destruktiv sjukdom, och ger oss möjlighet att kunna modulera immunsystemet i önskad riktning.

Nya projekt
Immunomodulering av T-hjälpar celler vid IDDM Initialt kommer bananflugceller etableras med uttryck utav humana klass II och kostimulatoriska molekyler. Därefter kommer metodologin utvärderas in vitro med renade T celler ifrån patienter med nyupptäckt IDDM för att om allt faller väl ut användas i terapi syfte. Humana klass II och kostimulatoriska molekyler B7.1, B7.2 och ICAM-1 har klonats in i flugvektorn pRMHa3 och stabila transformerade flugcells linjer har selekterats. Hittills har HLA-DR3 och DR4 cell linjer skapats. Andra klass II molekyler kommer att klonas på samma sätt när sytemet har etablerats.

För att utvärdera systemet i människa så kommer renade CD4+ Th celler ifrån patienter med nyupptäckt IDDM att undersökas eftersom dessa patienter har förhöjda nivåer utav aktiverade Th celler i perifert blod. Vidare så har flera autoantigen vid IDDM identifierats såsom glutamat decarboxylase och insulin mfl. I de inledande pilot försöken aktiveras renade CD4+ Th celler ifrån patienter med IDDM mha Drosophila celler som uttrycker HLA-DR4 (DRB1*0401) samt olika kombinationer utav kostimulatoriska molekyler. Antigen specifik aktivering kommer att mätas med T cells proliferation. Produktion av cytokiner kommer att karakteriseras med specifik ELISA och eller intracellulär FACS. Detta så att kombinationen av molekyler som behövs för att styra cytokin produktion till Th1 respektive Th2 kan faställas på samma sätt som vi nyligen upptäckt i mus systemet.

Att studera T cellers reaktivitet vid autoimmuna sjukdomar har hittills varit mycket svårt då prekursor frekvensen förmodligen är låg. Tekniker som använts har involverat ständiga restimuleringar in vitro för att skapa T cells kloner och limiting dilution assays. Risken att selektera felaktiga celler är uppenbar och det omöjliggör rent praktiskt att följa dynamiska skeenden. Med nyligen publicerade tekniker kan dock detta ske framgångsrikt mha tetrameriska transplantationsantigen och flödescytometri som nyligen blivit beskivet för mus klass I och LCMV infektion

Samarbete

I samarbete med Lars Karlsson (RW Johnson, La Jolla) så har en biotenyleringssekvens introducerats in i cDNA kodandes för den lösliga HLA-DR alfa kedjan så att uttryck av heterodimeriska klass II komplex i flugceller kan genomföras. Klass II molekylerna som inducerats till uttryck i stabila flugceller utsöndras till mediat och renas därefter med ultrafilterings teknik följt av affinitetskromatografi och gelfiltrering. Renade, biotenylerade klass II molekylerna laddas därefter med lämplig antigen peptid, tex en GAD deriverad peptid.

När metodologin enligt ovan etablerats kommer en prospektiv studie utav renade Th celler ifrån patienter med nyupptäckt IDDM startas. Förekomst av autoreaktiva Th celler emot olika autoantigen såsom GAD och Insulin kommer att påvisas med immuno-proliferations assays efter stimuli utav transfekterade och peptid laddade flugceller. Prekursor frekvensen studeras med tetramerisk klass II teknik och FACS analys och cytokin produktion påvisas med intracellulär FACS så att Th1 respektive Th2 profiler kan erhållas. Tanken är att sedan att följa patienternas Th cells mönster under den initiala honeymoon perioden och korrelera Th cytokin profiler och prekursor förekomst med kvarvarande C peptid produktion och se om Th profilerna ändras med tex _ cells vila.

Vid IDDM råder en obalans i Th1/Th2 systemet med en övervikt av Th1 cytokin producerande Th celler vilket leder till destruktion utav _-cellerna i pankreas och klinisk diabetes. Genom att aktivera renade CD4+ Th celler ifrån patienter med IDDM med hjälp av flugceller transfekterade med HLA-DR4, B7.1 och/eller B7.2 så erhålls cytokin producerande celler av Th2 slag (IL-4, IL-12). Dessa celler kan sedan expanderas ex vivo och transfusion av Th2 celler till patienten skulle hämma de destruerande Th1 cellerna då tex IL-12 inhiberar Th1 celler, därmed skulle balans i systemet erhållas (Figur 2). Patient säkerheten med att använda cytotoxiska T celler aktiverade av klass I transfekterade flugceller genomgår nu fas I studier av RW Johnson i syfte att bota malignitet. Resultaten ifrån dessa undersökningar ligger sedan till grund för om autolog transfusion av Th2 celler kan användas för tidig terapi vid IDDM tex hos patienter med GAD autoantikroppar utan kliniska tecken på _-cells svikt, för att åstadkomma en immunologisk balans.

Betydelse
Vid autoimmun organspecifik sjukdom angrips och förstörs målorgan utav en felaktig aktivering mot egna strukturer utav T lymfocyter med en Th1 cytokin obalans. Vid allergi ses en Th2 dominerande aktivering och vid många cancer sjukdomar är aktiveringen av immunsystemet otillräcklig.

För att erhålla ökad förståelse för uppkomstmekanismerna och få möjlighet till immunologisk intervention hos patienter erfodras kunskaper och metodologi for att studera och manipulera T celler. Genom att i Dr Per Petersons laboratorium ha etablerat artificiella antigenpresenterande Drosophila celler har unika möjligheter erhållits att förstå mekanismerna bakom autoimmunitet och allergi.

Det möjliggör studier för att modulera immunsystemet hos patienter med autoimmun sjukdom, allergi eller cancer på ett molekylärt skräddarsytt sätt.

Ola Winqvist Läkare
Medicine Doktor
Inst för Medicinska Vetenskaper
Akademiska Sjukhuset
751 85 Uppsala

E-mail: ola.winqvist@medicin.uu.se



Vill du bli medlem i Svensk Förening för Diabetologi (SFD) ?

- och få DiabetologNytt 4 nummer per år och tillgång till www.diabetolognytt.com och www.sdn.nu med Svenskt Diabetologiskt Nätverk, DiabetoFax samt möjlighet till diabetologiskt nyhetsbrev om Du vill via email var 6:e vecka?

Kostnad 0 kr 1999, och 80 kr 2000. Alla inom diabetesteamet är välkomna att bli medlem i SFD.
Faxa till 031- 270087 uppgifter om namn, adress och yrke, så blir Du medlem och får tillgång till en kontinuerlig fortbildningsmöjlighet inom Diabetes


Red




[Innehåll] [Redaktören] [Ordföranden] [Sett & Hört] [Aktuell Info] [Redaktionen] [Arkivet] [Länkar] [Diskussionsforum] [Diabetes Update]
Till Förstasidan