Av Karin Hehenberger, Institutionen för Molekylärmedicin, Enheten för Endokrinologi och Diabetologi, Karolinska Institutet, Stockholm

Fotsåren är ett problem
Diabetiska senkomplikationer såsom angiopati, retinopati, nefropati och neuropati har blivit allt mindre förekommande, tack vare förebyggande vård i form av blodsockerkontroll och adekvat behandling i tid. Trots detta är de diabetiska fotsåren fortfarande en källa till stora sjukvårdskostnader och handikappande tillstånd för patienterna. Sårvården i form av metabol kontroll, debridering och infektionsbekämpning är viktig, men trots aktiva insatser från hela diabetesteamet är såren svårläkta. Därför är forskningen på detta område viktig, och nya behandlingsmetoder eftersträvas. Diabetiska sår har nedsatt läkningsförmåga och man måste känna till den normala sårläkningsprocessen för att kunna förstå defekterna i den diabetiska sårläkningen. Den normala sårläkningen består av flera faser; inflammatorisk fas, proliferativ (granulations) fas och mognadsfas. Kroniska diabetiska sår har en fördröjd och ofullständig granulationsfas vilket förhindrar mognadsfasen. I den proliferativa fasen av sårläkningen spelar fibroblasterna en stor roll. Detta har föranlett oss till att studera fibroblaster från oskadad hud och kroniska sår, från diabetiker och icke-diabetiker. Dessa studier har bedrivits på Karolinska sjukhuset under ledning av docent Kerstin Brismar, docent Anders Hansson och dr Gunnar Kratz, och i samarbete med dr Folke Lind och dr Johan Heilborn.

Humana fibroblaster
Vi har studerat humana fibroblasters tillväxt och adhesion vid olika tillstånd. Stansbiopsier har tagits från sår och oskadad hud, från diabetiker och icke-diabetiker, och placerats på plast med odlingsmedium (10% serum+penicillin+streptomycin) täckande hudbitarna. Från dessa växer fibroblaster ut, och deras morfologi observeras noggrant till dess att de är konfluenta. Därefter sättes cellerna om, och försök kan utföras. Vi har mätt proliferationen med en fluorometrisk metod, vilken bestämmer total DNA, som är proportionellt mot cellantal.

Kliniska observationer
Kliniska observationer gällande heparins (lokalt eller systemiskt) sårläkande effekter, gjorde att vi blev intresserade av att studera dess in vitro effekter. Man har funnit att bovina aortaendotelceller (BAE) som har blivit stimulerade av heparin, ökade sin proliferation. Dessutom stimulerade mediet, i vilket BAE cellerna hade växt i närvaro av heparin, Balb/c 3T3 musfibroblaster att växa. Detta talar för en aktivering av endogent bFGF av heparin. Andra grupper som har studerat Balb/c 3T3 mus fibroblaster och humana fibroblaster, har detekterat en minskad DNA mängd efter heparin behandling. Lågmolekylärt heparin (Fragmin) har, i en klinisk studie, givits subkutant till patienter med svårläkta sår. Denna behandling förbättrade sårläkningen och mikrocirkulationen i huden, utan att påverka makro-cirkulationen hos patienterna. Kliniska studier med lokalt applicerat heparin på kroniska diabetiska och kroniska icke-diabetiska sår pågår på Karolinska sjukhuset. Vi har sett att fibroblaster från kroniska diabetiska sår växer och/eller adhererar sämre än normala celler. Vår tanke var att söka optimera omgivningen på olika sätt för att få dem att tillväxa lika snabbt som normala celler. Vi har funnit att heparin ökar cellproliferatio-nen, mätt som DNA innehåll, 3H-thymidin inkorporering och cellantal, av Swiss 3T3 musfibroblaster samt humana fibroblaster. De humana fibroblasterna kom från oskadad hud och kroniska sår hos friska kontroller, och diabetiker. Heparinets effekter på proliferationen var dosberoende, mest uttalad under de första 24 timmarna, och inte beroende av serum. Heparinets tillväxtfrämjande roll kan tänkas bero på den effekt som heparin har på tillväxtfaktorer. Skyddet mot degradering samt den faciliterade ligand-receptor kontakten är möjliga mekanismer. Man kan inte heller utesluta att heparins koppling till cellmatrix betyder något för celladhesionen.

Zink-studier
Zink är en spårmetall som spelar en betydande roll i proteinstruktur och funktion, men är även kopplad till cellproliferation. Zink är bundet till albumin och (2-makroglobulin i plasma. Zinkoxid har använts i sårförband, och lokal applikation har visats öka både lokala och systemiska zinknivåer. Sårläkningen förbättrades efter lokal applikation av zink, i både en gris- och en människomodell. Förklaringen till detta, kan bero på induktion av tillväxtfaktorer, såsom IGF-1. IGF-1 är en tillväxtfaktor som bl.a. produceras av fibroblaster, och har stor tillväxtfrämjande förmåga. Förbättrad sårläkning har påvisats efter lokal applikation av IGF-1 i kombination med rekombinant IGFBP-1. Studier har visat att zink inducerar både MAP kinas och protein tyrosin fosforylering. Zink kan påverka cellerna extracellulärt eller intracellulärt. En grupp har föreslagit att zink påverkar cellmembranet till att bli mer stelt, eller att den inneboende enzymatiska aktiviteten i membranet påverkas. Intracellulära verkningar kan medieras genom inhibition av proteintyrosinfosfataser. När vi studerade zink, såg vi att zink inducerade ökad cellproliferation av både fibroblaster från mus och människa, mätt med fluorometrisk och 3H-thymidin inkorporerings metod. Maximal stimulation av cellerna med zink visade sig vara 2 timmar. Ökning av MAP kinas aktiviteten har detekterats med western blot, maximal aktivitet var efter stimulering med 100uM zink. Medium från celler stimulerade med zink kunde överföras till ostimulerade celler, och påverka dessa till ökad proliferation.

Vidhäftningskapacitet
Glatta muskelceller från diabetiska BB råttor har sämre vidhäftningskapacitet (plating efficiency) än glatta muskelceller som kommer från friska kontrollråttor. Celler fäster till varandra och till underlaget genom komplex mellan substratet i underlaget och cellens adhesionsmolekyler. Dessa molekyler avgör också i vilken riktning cellerna väljer att orientera sig. Studier har visat att vissa integriner krävs för att celler skall adherera till material såsom kollagen. Det finns även resultat som visar att aktivering av specifika integriner avgör inträde i apoptos. Normala endotel och epitelceller genomgår apoptos när cellerna ej längre är fästa vid underlaget. Om cellerna hålls i suspension minskar nivåerna av integriner successivt. Man har funnit att höga glukoskoncentrationer inducerar höjningar i integrinreceptorer och fibronektin. Hos diabetiker kan denna överexpression av cellvidhäftningsmolekyler accelerera mikroangiopatin som ofta ger ögonpåverkan. Trots en överproduktion av fibronektin bildas inte lika många fibronektin-kollagen komplex hos diabetiker, som hos friska kontroller. Detta beror på den non-enzymatiska glykosyleringen som förändrar fibronektins affinitet för kollagen. Studier av fibroblaster från kroniska sår jämfört med fibroblaster från normal vävnad, visade att sårfibroblasterna interagerar sämre med fibronektin än vad de normala fibroblasterna gör. Eftersom fibroblaster även producerar en mängd egna tillväxtfaktorer, kan en minskad vidhäftning till underlaget spela stor roll för cell-cell kommunikationen, samt de para och autokrina effekterna. Vi har studerat fibroblaster odlade från icke-diabetiska och diabetiska kroniska sår och icke-diabetisk och diabetisk oskadad hud. Vi fann att fibroblaster från diabetiska kroniska sår hade en sämre proliferativ förmåga även efter flera odlingspassager mätt som DNA-syntes. Orsaken är oklar men vi har sett att fibroblaster som kommer från friska kontroller (mammarhud) och fibroblaster från kroniska diabetiska sår, visar olika benägenhet att fästa vid underlaget. Efter 2, 4, 6, 8 och 24 timmar efter initial utsådd, har de diabetiska cellerna inte fäst i samma utsträckning som de normala. Efter 24 timmar kvarstår den sämre proliferationen hos de diabetiska cellerna. Samma fenomenses när jämförelsen mellan fibroblaster från NIDDM-råtta (GK) och Wistar görs.

IGF-1
Non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM) är förenat med beta-celldysfunktion och insulinresistens. Kronisk hyperglycemi i sig kan leda till insulinresistens, pga minskningen av antalet glukostransportörer. NIDDM är förenat med höga triglycerider och högre kortisonnivåer vilket ytterligare bidrar till resistens. Vi har studerat dexametasonets effekter på IGF-1s aktivering av den intracellulära signalkedjan. Det visades att förbehandling under 48 timmar med 100nM dexametason inhiberade IGF-1- inducerad MAP kinas aktivering. Det finns olika sätt att behandla insulin-resistens. Några normaliserar metabola parametrar och blodsockret, exempel på sådana läkemedel är insulin och sulfonylurea. Andra ökar känsligheten i perifera vävnader för insulin; biguanider och thiazolidindion derivat påverkar glukos transportörers translokation till membranet i närvaro av insulin. Ytterligare en mekanism är den som IGF-1 och vanadat utför, en aktivering av IGF/insulinreceptorn.

Hyperglykemi och kinasaktivitet hos insulinreceptorn
Hyperglycemi har funnits inducera insulinresistens på receptornivå. Detta har man sett överensstämma väl med en sänkt kinasaktivitet hos insulinreceptorn. In vitro studier av fibroblaster från råtta, som överuttryckte humana insulinreceptorer, visade att höga glukosnivåer hämmade insulinreceptorns kinasaktivitet. In vivo studier på NIDDM-patienter har visat att det finns ett inverst förhållande mellan faste-glukos och insulinreceptorns kinasaktivitet i skelettmuskel. Den hämmade insulinreceptoraktiviteten beror troligen på ökad proteinkinas C-aktivitet. Insulinreceptorns aktivitet är sänkt beroende på ökad fosforylering av betasubenheten hos insulinreceptorn. En annan förklaring skulle kunna vara en ökad aktivitet av cytosoliskt protein-tyrosin-fosfatas (PTPas). Fria syreradikaler spelar stor roll i patogenesen för en mängd sjukdomar. Hyperglycemi och diabetes ökar diacylglycerol (DAG) nivåerna, och aktiverar protein kinas C (PKC) i blodkärl. Detta kan påverka blodflödet i en negativ riktning, och på så sätt ge diabetisk kärlsjukdom.

Vitamin E
Vitamin E har studerats i samband med detta, och man har funnit att det återställer DAG nivåerna, och därmed minskar aktiveringen av PKC. Detta betyder att vitamin E kan reversera den hyperglycemiska aktiveringen av PKC, som leder till insulinresistens och påverkan på lipidsyntesen. Troligen beror denna mekanism på vitamin E:s antioxidativa effekt.

Laktatnivåer och heparin
Hyperglycemi ger ökade laktatnivåer hos patienter, vid NIDDM är laktatnivåerna redan förhöjda basa antikoagulativa effekter, men har också visats modulera flera stadier i sårläkningen. Heparin påverkar flera tillväxtfaktorer, bl.a basic FGF (fibroblast growth factor), som produceras av fibroblaster. FGF kräver dessutom heparin för att binda till sina receptorer. Heparin skyddar FGF från att bli degraderad av syror, värme och proteaser. Studier har visat att humana förhudsfibroblaster producerar bFGF. Heparin binder även till extracellulär matrix och är involverat i adhesionen. Dessutom kan heparin bli internaliserat, och brytas ned till oligosaccharider inne i cellen. Dessa kan möjligen fungera som en energikälla. Heparin förhindrar nedbrytningen av IGFBP-5 (insulin-like growth factor binding protein 5), genom att förhindra proteolys eller genom att binda till IGFBP-5, eller genom bägge mekanismerna. Humana fibroblaster secernerar IGFBP-5, vilket har visats sig vara en potentiator av IGF-1s (insulin-like growth factor 1) mitogena effekter. Flera grupper har studerat hur heparin påverkar cellproliferation. Laktat är ett mått på den icke gynnsamma energiproduktionen vid anaerob metabolism.

Hyperglykemi hämmar cellproliferation i fibroblaster
Vi har funnit att högt glukos (25mM ) hämmar cellproliferationen i fibroblaster från mus och människa. Dessutom ökar laktatnivåerna i medium från glukosstimulerade fibroblaster, och de basala nivåerna hos NIDDM-celler är förhöjda. Försök med L-glukos och fruktos visade inte samma effekt, vilket utesluter osmotiska och glykosyleringseffekter som förklaring till hämningen. Insulinresistens vid hyperglycemi i humana fibroblaster har redan tidigare beskrivits i litteraturen, men vi har även visat att det finns en resistens mot andra tillväxtfaktorer såsom IGF-1 och EGF. Den hyperglycemi-hämmade cellproliferationen kunde fullständigt reverseras med vitamin E och Q10, delvis reverseras av dimetyltiourea, (-karoten, selenit, vitamin C samt en specifik PKC hämmare; H7 och bisindolylmaleimide IX. IsoH7 och DMSO påverkade inte alls cellproliferationen. Detta får oss att tro att fria radikaler har en negativ påverkan på cellproliferationen, och eventuellt har betydelse i utvecklandet av diabetiska senkomplikationer. Den ökade laktatproduktionen hos diabetiska fibroblaster tyder på ett övervägande anaerobt utnyttjande av glukos.

Hypoxi
Kroniska sår är ofta hypoxiska, vilket fördröjer möjligheten till fullständig läkning. Hos diabetiker leder mikroangiopatin och/eller makroangiopatin tillsammans med ökad mängd glykosylerat hemoglobin till minskad oxygenering av vävnaden. Under förhållanden med ökat O2 behov, såsom sårläkning, blir O2 bristen ännu större. Man har sett att hyperbar O2 behandling av patienter med kroniska hypoxiska sår kan påskynda sårläkningen. Vi har studerat hur fibroblaster från kroniska diabetiska sår och oskadad icke-diabetisk hud påverkas av korta inkubationer med hyperbar oxygen i olika doser. 24 timmar efter en timmes inkubation med hyperbar oxygen, dvs pO2 > 100 kPa, ökade fibroblast-proliferationen både hos dem från diabetiska kroniska sår och från friska kontroller. Den maximala cellproliferationen uppnåddes vid 250 kPa för de normala (43 % ökning) och vid 200 kPa för de diabetiska (63 % ökning) fibroblasterna. Fibroblaster från kroniska diabetiska sår har sämre proliferativ förmåga och nedsatt viabilitet jämfört med fibroblaster tagna från friska kontroller. Hyperbar oxygen har en stimulerande effekt på cell proliferationen, denna effekt är maximal omkring 200 kPa, och avtar vid högre tryck. Dessa effekter torde vara av betydelse för sårläkningen hos diabetespatienter med kroniska hypoxiska sår.

Observationer av betydelse för framtida behandlingsprinciper
Vi vill med dessa studier säga att det finns mycket inom den diabetiska sårläkningen som är okänt, och värt att utforska. Det går självklart inte att dra direkta kopplingar mellan in vitro studier och kliniska applikationer, men mekanismerna för fibroblasternas störda funktion är intressanta för in vivo situationen. Vi vill tro att våra observationer kan komma att få betydelse för framtida behandlingsprinciper vid kroniska diabetiska fotsår.

Karin Hehenberger
Institutionen för Molekylär Medicin, Enheten för endokrinologi och diabetologi, Karolinska Institutet, Stockholm,
karin.hehenberger@molmed.ki.se
fax 08 30 34 58, tfn 0740 - 30 38 58

---

Karin har till Svensk Förening för Diabetologi inlämnat ansökan om resestipendium och tilldelades 970408 10.000:-. Vi ser fram emot en spännande reserapport