Forskning vid Diabetes Research Centre, Linköping

Sedan drygt 30 år tillbaka har det funnits en mycket aktiv diabetesforskning i Linköping. År 2003 gjorde Linköpings Universitet och Landstinget en satsning på 6 olika strategiområden som fick utformas och sökas i konkurrens. Strategiområdet "Prevention av diabetes och dess komplikationer" tillskapades då och det blev starten för Linköping Diabetes Research Centre (http://www.hu.liu.se/imk/pediatrik/diabetes-research-centre) som etablerades 1 juli 2004. Inom strategiområdet bedrivs omfattande forskning och forskarutbildning. Strategiområdet har givit möjlighet till samordning och interaktion mellan forskargrupperna och tillskapat en mycket kreativ miljö. Nedanstående artiklar beskriver viktiga delar av verksamheten.

Alla Barn i Sydöstra Sverige (ABIS)
En prospektiv populationsbaserad longitudinell kohortstudie om orsaker till diabetes. Johnny Ludvigsson, professor Avdelningen för pediatrik Hälsouniversitetet, Linköping
ABIS - en viktig gemensam resurs för Diabetes Research Centre i Linköping ABIS är en ganska unik studie av en icke selekterad barnpopulation med uppbyggnad av en värdefull iobank som möjliggör studier av miljöfaktorers betydelse för uppkomst av immundeviation och associerade sjukdomar, inte minst diabetes. I projektet deltar nu forskare från olika fakulteter och med olika specialområden (se www.liu.se/abis). Genom att angripa frågeställningar med olika kompetens så hoppas vi kunna öka kunskapen om dess orsaker, och kanske kan vi i framtiden därigenom förebygga en del fall. Härtill kan ABIS ge möjligheter att predicera vilka som är högriskindivider i den allmänna befolkningen, vilket kan ge möjlighet att behandla profylaktiskt högriskindivider även i allmän barnbefolkning. Detta kommer att vara av utomordentligt stor betydelse. I bästa fall kan kunskapen uppnås så tidigt att barn som ingår i ABIS kan ha egen nytta av att bli identifierade som riskindivider och få möjlighet att delta i förebyggande behandling senare. Vi har ju studier på gång med ex GAD-vaccination för att mildra förloppet vid debut av diabetes, som om de skulle ge lovande resultat bör kunna utvidgas till att intervenera på friska barn med tecken på ökad risk att utveckla diabetes.

ABIS en gigantisk biobank
ABIS startades 1997 ABIS Mödravårdcentraler, Förlossningskliniker, Barnavårdcentraler, Vårdcentraler och Barn-kliniker i Östergötland, Småland, Blekinge och Öland deltar/har deltagit i studien. Redan på Mödravårdcentralerna informerades de blivande mammorna om studien med hjälp av affischer och videofilmer producerade för ändamålet, plus skriftlig information. Av mammorna till de c:a 21.700 barn som fötts under två år inom regionen gick drygt 17.000 in i studien (78.6%). Vid barnets födelse togs navelsträngssprov. På BB besvarade mamman ett frågeformulär
Drygt 100 frågor ställdes angående ex infektioner under graviditeten, frågor om kost, rökning, alkoholkonsumtion under graviditeten, bostadsförhållanden, bostadens konstruktion, närhet till industrier, vissa basala sociala förhållanden, hereditet för autoimmuna eller allergiska tillstånd, yrkesexponering för mamman, resp. för pappan före graviditeten. På BB fick mamman lämna hårstrån, och bröstmjölk förvaras för att v.b. senare kunna analyseras på sitt innehåll av ex miljögifter, fettsyror. Drygt 16.000 mammor har lämnat ovanstående prover.

Fig 1. Design ABIS. Till detta adderas nu ABIS-II med kontroller vid 8, 11 och 14 års ålder.

Före hemgång från BB fick mamman information om att under barnets första levnadsår registrera fortlöpande i enkel "dagbok" hur och när olika födoämnen introducerades i barnets kost. Mamman ombads också registrera om och när barnet drabbas av infektioner och vilken sort, om läkare kontaktas, läkemedel krävs etc. Härtill noterades givna vaccinationer, psykosocial situation, allvarliga livshändelser mm.
I samband med 12-månaderskontroll på Barnavårdcentral lämnades Dagboken in på BVC. Hårstrån togs från barnet liksom blodprov på barnet. C:a 11.000 mammor fullföljde registrering med "dagbok" och fler än förväntat, c:a 13.900 deltog i 1-årskontrollen. I kontrollen vid 2.5-3 års ålder varvid togs blodprov, urinprov, avföringsprov, hårstrån från barnet plus att ett omfattande frågeformulär besvarades deltog c:a 11.800 barn Vid 5-6-årsåldern togs, förutom samma som vid 2.5-3 års ålder venprov. Mononukleära celler har separerats fram och frysts i flytande kväve för senare studier av cellmedierad immunitet. Totalt har material samlats in från drygt 8.000 barn.
ABIS-materialet är samlat i Linköping. Inalles finns c:a 350.000 biologiska prover från drygt 36.000 individer ( barn, mammor, och en del pappor), och mer än 10 miljoner uppgifter om dessa individer, ett material som utgör en oerhörd källa till information om barndomens betydelse för uppkomst av olika sjukdomar både i barndomen och senare i livet.

ABIS-II har börjat
ABIS projektet har nu övergått i en ny fas i och med att barnen börjar skolan. Efter förnyad etisk prövning har godkänt att fortsatta kontroller ska genomföras vid 8,11 och 14 års ålder. Alla de 17.000 som initialt deltagit kontaktas och anslutningen kan förhoppningsvis bli god.

Etik och attityder till studien studeras
Våra studier har visat att den övervägande majoriteten av ABIS-föräldrar tycker att deltagande i projektet faktiskt är lugnande, om det alls berör dem, och endast någon procent av föräldrarna har angett ökad oro. Men givetvis medför ett projekt som ABIS etiska problem. Detta förhållande har inte sopats under mattan utan tvärtom legat till grund för regelrätta studier av etik och attityder och har hittills lett fram till en doktorsavhandling om "Etiska Aspekter på storskalig screening". Dessa studier fortsätter i samarbete med flera professionella etiker/forskare med viktiga och intressanta frågeställningar som ex när och hur man ska informera, när och hur de deltagande barnens åsikter ska vägas in i beslut etc .

ABIS har redan gett intressanta resultat
Nej, vi har inte löst diabetesgåtan! Vi har heller inte förväntningarna att göra det, men vi hoppas kunna ge värdefulla bidrag, komma med våra strån till stacken. Redan i tidigt skede bildar friska barn i den allmänna befolkningen låga koncentrationer av diabetesrelaterade autoantikroppar, som mestadels är transienta, men hos en minoritet består och ibland blir multipla. Transienta autoantikroppar tycks in närmare vara associerat till HLA-typ medan däremot själv utvecklingen till multipla autoantikroppar eller höga koncentrationer är associerat till HLA-risk.
Inte bara HLA utan också CTLA-4 tycks vara involverat i immunbalansen. Vi har funnit traditionella samband med ex tidig introduktion av komjölk i kosten, onormalt tidig eller onormalt sen introduktion av gluten, och med infektioner under graviditeten, men också andra intressanta samband mellan diabetes-relaterade autoantikroppar och faktorer som normalt förknippas med uppkomst av Typ 2 diabetes ( Typ 2 diabetes i släkten, stress, allvarliga livshändelser). Detta har föranlett oss att alltmer fokusera våra studier på kopplingen mellan Typ 1 och Typ 2 diabetes och vi bedriver nu forskning som rör inte minst kost, motion, stress och dessa faktorers betydelse för utveckling av övervikt, fetma, nedsatt glukostolerans, ökad antigenpresentation från Langerhanska öarna, och ev diabetesrelaterad autoimmunitet, och kanske i vissa fall rentav Typ 1 diabetes (för publikationer se www.liu.se/abis ).

The role of gut immune system in type 1 diabetes
Outi Vaarala, professor Avdelningen för pediatrik Hälsouniversitetet, Linköping
In type 1 diabetes, harmful immune response to self-insulin develops and this leads to the destruction of insulin-producing beta-cells in pancreas. We do not know the reasons for this but the predisposition to type 1 diabetes is linked to certain genetic factors. The role of environmental factors in the development of type 1 diabetes is however crucial, since only small proportion of children (2-10%) with genetic risk get type 1 diabetes. As markers of the disease process beta-cell autoantibodies are seen in the blood of the children who have developed immune response to insulin and other structures of beta-cells.
Convincing data show that the incidence of T1D has increased considerably in most industrialised countries after World War II; the incidence rate has increased about fourfold over the last 50 years in Sweden. These kind of rapid changes are likely influenced by changes in environmental factors or in the host responses to environmental factors related to the disease process. During the past decades indirect evidence has accumulated supporting the view that risk of type 1 diabetes is modified by the environmental microbial load, which plays a crucial role in the maturation of the host immune system over the first few years of life. The hygiene hypothesis suggesting that high hygiene leads to poor function of immune system and to the development of immune mediated diseases, such as type 1 diabetes in children has gained support from studies in an animal model of autoimmune diabetes. In NOD mice the incidence of spontaneous autoimmune diabetes is highest in an environment with a low microbial load and decreases when the microbial load increases. Interestingly, the administration of heat-killed Lactobacillus casei has been shown to decrease the incidence of diabetes in NOD-mice.
The gut immune system plays a key role in the development of several immune-mediated diseases, such as food allergies and celiac disease. Studies by our group and others indicate that aberrancies in the gut immune system, such as intestinal immune activation occurs in children with type 1 diabetes. Also enhanced immunity to food antigens and increased gut permeability is seen in children with type 1 diabetes.
The gut immune system appears to have a dual role; it provides defense mechanisms against infectious agents but also induces tolerance to harmless food and microbial antigens encountered in the gut. Health of the gut immune system is a necessity for the development of oral tolerance, which is a major compartment of peripheral tolerance. The role of intestinal microbes in the regulation of the intestinal immune system and in the induction of oral tolerance is crucial.
Oral tolerance can be enhanced or inhibited by microbial agents administered together with antigens. Noninvasive microbes such as probiotics seem to support the development of oral tolerance. The definition of probiotics ("for life") is as follows: microbial cell preparations or components of microbial cells which have a beneficial effect on the health and well-being of the host. Lactobacilli and bifidobacteria, which are used as probiotics, have been a natural component of the diet when fermentation has been used for facilitating the storage of food.
Enteral virus infections, such as enterovirus and rotavirus infections have been associated with the development of beta-cell autoimmunity and progression to T1D in children at genetic risk. Our studies in Linköping show that children with type 1 diabetes have impaired cell-mediated immune response to enteroviruses, which may indicate that they are not able to eradicate enterovirus as effectively as healthy children. Accordingly, prolonged enterovirus infections may cause problems in their. Enterovirus may destroy beta-cells and release self-antigens which trigger immune system. Several studies indicate that probiotics are beneficial in the treatment of gastrointestinal infections. These clinical effects may be based on both immuno-enhancing and colonisation effects of these probiotics. It seems that colonisation of the gastrointestinal tract with lactobacilli interferes with the colonisation of entheropathogenic micro-organisms .
Based on these background reasons, we have initiated a clinical study in Linköping to evaluate the immunomodulatory effects of probiotics in the prevention of type 1 diabetes. A pilot study of PRODIA has been performed at the University of Linköping, Sweden, to test the feasibility of the trial design. Newborn infants have been recruited for the pilot study in the delivery hospital. 200 children with HLA genotypes conferring risk for T1D have been randomised to the pilot. The emergence of beta-cell autoantibodies are tested at 6, 12 and 24 months of age and virus infections are followed in order to see whether probiotics are able to modulate these risk factors of type 1 diabetes. Also development of oral tolerance to food antigens, such as cow milk insulin, is studied. The follow-up of the children in the PRODIA study is still going-on and the results are not available yet.
To further characterize the immunological changes in the gut immune system of the children with type 1 diabetes, we analyze intestinal biopsy samples taken from children with type 1 diabetes. We also follow the characteristics of insulin-specific immune response so that we could find better means to predict type 1 diabetes risk in children.

Betydelse av amyloid för betacellsskada
Gunilla Westermark, universitetslektor Avdelningen för cellbiologi Hälsouniversitetet, Linköping
Vi studerar de mekanismer, som föregår bildandet av amyloid i de Langerhanska öarna och dennas betydelse för betacellsskadan som förekommer vid typ 2 diabetes.

Amyloid
Ett proteins biologiska funktion är kopplad till dess sekundärstruktur och det finns flera system vilka assisterar proteiner i att anta rätt form eller, när det behövs, bryta ner och avlägsna dem. Trots detta finns det tillfällen då proteiner undgår korrigering eller degradation. Istället kommer de inlagras i vävnader och där leda till rubbningar i den normala funktionen. Sådana inlagringstillstånd hör till gruppen ¨felveckningssjukdomar¨ (mis-folding diseases) och inkluderar många olika sjukdomar t.ex. amyloidoser, Huntingtons sjukdom, amyotrofisk lateralskleros (ALS), och Creutzfeldt-Jakobs sjukdom. Amyloidoserna utgör den klart största gruppen och innefattar sjukdomar såsom Alzheimer sjukdom men amyloid är också karakteristiskt förekommande vid typ 2 diabetes. Amyloid är proteinaggregat där det ingående proteinet har förlorat sin nativa sekundärstruktur och istället aggregerat och bildat långa trådlika strukturer, s.k. amyloidfibriller, vilka har en diameter på 5-10 nm och är flera um långa. Man har visat att fibrillbildningen sker via olika intermediärer (oligomerer) som är toxiska för cellerna och leder till celldöd via apoptos. Oligomererna inkorporeras in i lipidmembraner och bildar där porer vilka leder till läckage och omöjliggör upprätthållandet av den intracellulär miljön. Därigenom skulle bildningen av amyloid vara skadligare än förekomsten av mogen amyloid, men även deponerad amyloid kan utgöra en fysisk barriär och leda till rubbningar i organets funktion. Hos människa förekommer minst 25 olika proteiner vilka kan bilda amyloid och varje protein är kopplat till en speciell sjukdom.

Öamyloid
Amyloid i Langerhans öar förekommer hos >95% av de individer vilka utvecklat typ 2 diabetes. Proteinet som aggregerat till amyloid benämns Islet Amyloid Polypeptide (IAPP) och är ett polypeptidhormon vilket produceras av betacellerna. Förekomsten av öamyloid anses i dag vara den huvudsakliga orsaken till det 50-60 %-iga betacellsbortfall som förekommer vid typ-2 diabetes.
IAPP syntetiseras som ett prohormon (proIAPP) vilket genomgår posttranslationell processning varvid ett N-terminalt och ett C-terminalt fragment avlägsnas. Denna enzymatiska spjälkning utförs av konvertaserna PC2 och PC1/3 och sker i de sekretoriska granula. Proinsulin processas till insulin av samma enzymer. Under normala förhållanden frisätts en liten mängd proinsulin tillsammans med insulin från betacellerna. I det tidiga skedet av typ 2 diabetes sker en proportionell ökning av mängden proinsulin och processningsintermediären C-peptid/A-kedja frisätts från betacellerna. Motsvarande förändring av proIAPP processningen förväntas förekomma.

Öamyloid och typ 2 diabetes
Det finns flera omständigheter som talar för att det finns en koppling mellan öamyloid och typ 2 diabetes Öamyloid påvisas hos >95 % av typ 2 diabetiker medan öamyloid bara förekommer hos 10 % av icke diabetiker i samma åldersgrupp Amyloidmängden korrelerar till behandlingsbehovet och de fall där insulinbehandling skett påvisas mer amyloid En mutation i position 20 av IAPP vilken resulterar i att aminosyran serin ersätts med glycin ökar risken för att utveckla typ-2 diabetes. Öamyloid förekommer förutom hos människa även hos katt och apa och då vid tillstånd som liknar den mänskliga formen av typ 2 diabetes.
Vi har visat att den posttranslationella processningen av proIAPP har betydelse för uppkomsten av amyloid. Genom att uttrycka humant proIAPP i endokrina celler vilka ej uttrycker PC2 och PC1/3 och därigenom saknar möjlighet att processa proIAPP till IAPP bildas intracellulär amyloid. Uttryck av humant proIAPP i betaceller vilka producerar PC2 och PC1/3 och därigenom processar proIAPP till IAPP förhindrar amyloidbildning (4). Proinsulins processningsintermediär C-peptid/A-kedja uppkommer efter det att PC1/3 processat proinsulin varvid B-kedjan avlägsnats, men den efterföljande PC2 spjälkning saknas. Motsvarande klyvning av proIAPP leder till att det C-terminala fragmentet avlägsnas och kvar blir IAPP med det N-terminala fragmentet (NIAPP) Uttryck av humant proIAPP i AT-T20 celler, en endokrin cellinje vilken saknar PC2 men uttrycker PC1/3, leder till att NIAPP ansamlas i cellerna som amyloid. IAPPs amyloidbildande egenskap beror på aminosyrasekvensen och öamyloid bildas aldrig i mus och råtta. Detta är den troligaste orsaken till att amyloiddeposition och åtföljande betecellsskada rönt ringa intresse bland områdets forskare. Flera musstammar som uttrycker humant IAPP har framställts och här föregår bildningen av öamyloid diabetes. I den transgena musstam, som vi använder oss av, återfinns amyloid såväl extracellulärt som intracellulärt. Denna diskrepans mellan mus och människa, där amyloid hos den senare arten endast återfinns extracellulärt, beror sannolikt på skillnader i kvantitet. Elektronmikroskopiska studier av amyloidinnehållande celler från transgen mus demonstrerade fibrillära aggregat i sekretoriska granula och vi har med immunologiska metoder visat att dessa fibriller består av proIAPP medan merparten av den övriga intracellulära amyloiden utgörs av IAPP (fig 1A och 1B). Med rekombinant teknik har vi framställt proIAPP vilket har en hög tendens att aggregera till amyloid-lika fibriller. Dessa kan injiceras intravenöst på möss från den transgena stammen och de fibriller vilka fastnar i Langerhans öar fungerar som ¨seed¨ för nyproduktion av amyloid från IAPP som frisätts från omkringliggande betaceller.

Baserat på våra resultat arbetar vi efter följande hypotes: Den första amyloiden uppkommer intracellulärt, kanske i de sekretoriska granula och utgörs av proIAPP (Fig 2A). Dessa fibriller fungerar som kärna (¨seed¨) för fortsatt amyloidbildning och den fortsatta amyloidbildningen leder till apoptos (Fig 2B). Cellen faller sönder och om inte all amyloid avlägsnas kommer den att fungera som kärna för fortsatt amyloidbildning. Den amyloid som bildas nu kommer från IAPP som frisätts från de omkringliggande betacellerna (Fig 2C). Bildningen av den nya amyloiden kan introducera porer i betaceller och därigenom leda till ytterligare apoptos (Fig 2D).
Vårt fortsatta arbete inkluderar studier av de mekanismer som kan föregå intracellulär aggregation av proIAPP/IAPP, och här är förändringar av den intragranulära miljön intressanta. Vi studerar olika faktorer som kan påverka processningen av prohormonen och hur förändringar av prohormonsammansättningen påverkar amyloidbildningen. In vivo är det molära förhållandet mellan IAPP och insulin är 1:10, ett förhållandet vars ratio kan påverkas av kostsammansättningen. In vitro studier har visat att IAPPs amyloidbildande egenskap kan inhiberas av insulin och att denna inhibition är koncentrationsberoende. För att studera interaktion mellan proIAPP och proinsulin och prohormonernas processningsmetaboliter har vi etablerat en modell med hjälp av Drosophila melanogaster. Genom att dirigera proteinuttrycket till ögat kan rearrangering av ommatidia (del av facett ögat) till följd av proteinaggregation studeras. Genom att etablera dubbla transgener ska proteininteraktion/inhibition studeras

Typ 1 diabetes och amyloid
Transplantation av insulinproducerande öar anses vara en möjlig behandlingsstrategi vid typ-1 diabetes. I samarbete med prof. A Andersson och prof. P Westermark vid Uppsala Universitet studerar vi den amyloid som deponeras i humana öimplantat. Amyloid bildas snabbt i humana öar vilka implanterats under njurkapseln på nakna möss. I en studie från1995 visade man att IAPP-amyloid återfanns i 75 % av implantaten redan efter 2 veckor. Amyloidutecklingen är oberoende av implantationslokal och amyloid utvecklas i samma grad i öar vilka implanteras i levern, via porta injektion, eller under mjält- eller njurkapseln. Även i detta material förekommer intracellulär amyloid och man kan i vissa celler se att amyloiden är membranomsluten och kan antas vara deponerad i sekretoriska granula, golgi och ER (fig 3). I en immunelektronmikroskopisk studie med antikroppar specifika för proIAPP har vi visat att det även i detta material förekommer reaktivitet med antikroppar specifika för proIAPP. Fortsatta analyser inkluderar studier av processning av proIAPP och apoptosstudier. Denna studie är viktig inte enbart som modell för amyloidbildning utan också för att vi här har kunnat peka på en tidigare okänd mekanism, som kan vara av betydelse för att förstå varför humana öcellstransplantat slutar att fungera.

Insulinliknande tillväxtfaktorer och diabetes

Hans Arnqvist, professor Diabetesenheten och avdelningen för cellbiologi Hälsouniversitetet, Linköping.

Vad är insulinliknande tillväxtfaktorer
Insulinliknande tillväxtfaktorer är peptider, som är nära besläktade med insulin. Hos människa förekommer normalt insulinliknande tillväxtfaktor-I (IGF-I) och insulinliknande tillväxtfaktor-(IGF-II). Insulin, IGF-I och IGF-II har sannolikt utvecklats från en gemensam gen. Koncentrationen av IGF-II är flera gånger högre än IGF-I i blodet men det är framför allt IGF-I som har tilldragit sig stort intresse vid diabetes eftersom IGF-I på flera sätt regleras av insulin. Förutom att insulin och IGF-I strukturellt är nära besläktade med varandra är deras vävnadsreceptorer också mycket lika. Vid höga koncentrationer kan insulin och IGF-I aktivera varandras receptorer men det är oklart om detta händer i kroppen. IGF-I bildas huvudsakligen i levern och bildningen stimuleras av tillväxthormon. Till skillnad från insulin som bildas och lagras i betacellerna i bukspottkörteln lagras bildat IGF-I i blodet bundet till sex olika bärarprotein (IGFBP). Endast knappt 1% av allt IGF-I som finns i blodet är fritt och biologiskt aktivt. Om allt IGF-I som finns lagrat i blodet blev fritt skulle följden bli en svår hypoglukemi.

Vad gör IGF-I?
IGF-I stimulerar längdtillväxt hos barn och verkar uppbyggande på muskler och benstomme hos vuxna. Tillväxthormon som insöndras från hypofysen stimulerar bildningen av IGF-I och IGF-I svara för de anabola effekterna av tillväxthormon. I hjärtat och i kärlväggens endotel och glatta muskelceller finns rikligt med IGF-I receptorer. Halten IGF-I i blodet är som högst i puberteten och sjunker först snabbt och sedan långsamt med stigande ålder. Patienter med brist på tillväxthormon på grund av skada på hypofysen får nedsatt muskelfunktion och nedsatt bentäthet. De har också en ökad risk för hjärt-kärlsjukdom.

IGF-I och diabetes
Patienter med typ 1 diabetes har IGF-I nivåer som är 30-40% lägre än hos friska kontroller. Låga IGF-I nivåer förekommer också hos patienter med insulinbehandlad typ 2 diabetes. Vilken klinisk betydelse detta har är oklart men symtom från rörelseapparaten och hjärtkärlsjukdom är vanligt vid diabetes och detta kan ha samband med de låga IGF-I nivåerna.
De låga IGF-I nivåerna vid diabetes har tidigare ansetts bero på dålig sockerkontroll. Vi har undersökt sambandet mellan glykämisk kontroll mätt som HbA1c och IGF-I på patienter med typ 1 diabetes och vi kunde inte hitta någon korrelation.

Även i en grupp mycket välinställda (HbA1c<6%) patienter med typ 1 diabetes var IGF-I sänkt om patienterna helt saknade egen insulinproduktion (c-peptid<100nmol/l) medan patienter med delvis bevarad endogen insulinproduktion hade nära normalt IGF-I.
Under normala förhållanden insöndras insulin från pankreas betaceller till vena porta och når via portablodet först levern. Insulinkoncentrationen i portablodet är flera gånger högre än i resten av kroppen och levern får därigenom en "specialleverans" av insulin (se Figur1). Hos försöksdjur har man visat att insulin ökar antalet tillväxthormonreceptorer i leverceller och sannolikt gäller detta också för människa. Genom detta ökar insulin levercellernas känslighet för tillväxthormon vilket leder till ökad bildning av IGF-I. Dessutom nedreglerar insulin produktionen av IGFBP-1 i levern vilket ökar mängden fritt, bioaktivt IGF-I i blodet. Genom dessa två olika effekter på levercellerna ökar insulin bioaktivt IGF-I. När den egna insulinproduktionen upphört som vid typ 1 diabetes och insulin ges subkutant så når insulin levern i samma koncentration som resten av kroppen. Genom detta får levern en relativ insulinbrist vilket sannolikt är förklaringen till att vi fann sänkta IGF-I nivåer hos välreglerade patienter med typ 1 diabetes För att uppnå normalt IGF-I hos patienter som saknar egen insulinproduktion måste insulin sannolikt tillföras via vena porta t ex genom intraperitoneal pumpbehandling.

Insulin och IGF-I verkar genom att binda sig till specifika receptorer på cellernas yta. Receptorerna för insulin och IGF-I är mycket lika varandra (se Figur 2). Vid syntesen av receptorerna bildas först receptorhalvor innehålllande en -subenhet och en -subenhet. Receptorhalvorna kopplas sedan ihop till den färdiga receptorn (Figur 2). Eftersom insulin och IGF-I är mycket lika varandra kan det bildas hybridreceptorer som består av en halv insulinreceptor och en halv IGF-I receptor (Figur 2). Hybridreceptorerna verkar fungera som en IGF-I receptor. Insulin och IGF-I kan vid mycket höga koncentrationer binda sig till varandras receptorer. Troligen sker ej detta under normala förhållanden i kroppen. När insulinmolekylen ändras som vid tillverkningen av insulinanaloger kan bindningen till insulin och IGF-I receptorer förändras. Det är därför viktigt att undersöka hur nya insulinanaloger påverkar både insulin och IGF-I receptorer. Av de insulinanaloger som finns på Svenska marknade (Humalog®, Novorapid®, Apidra®, Lantus®, Levemir®) har Lantus en något ökad benägenhet att binda sig till IGF-I receptorer jämfört med insulin men detta har sannolikt ingen klinisk betydelse.
Troligen har alla celler i kroppen receptorer för både insulin och IGF-I men proportionerna varierar påtagligt. I lever och fettväv finns huvudsakligen insulinreceptorer, i muskler och i hjärta finns både insulin och IGF-I receptorer och i stödjevävnader som bindväv, brosk och ben finns huvudsakligen IGF-I receptorer. Vi har nyligen visat att endotelcellerna ifrån kärlvägg uttrycker betydligt mer IGF-I än insulinreceptorer och i kärlväggens celler förekommer också hybridreceptorer.
Sammanfattningsvis har patienter med diabetes som saknar egen insulinproduktion sänkta IGF-I nivåer i blodet. Dessa kan ej korrigeras med dagens subkutana insulinbehandling. Troligtvis beror detta på att insulintillförseln till levern är otillräcklig vilket gör levern okänslig för tillväxthormon. IGF-I har anabola effekter på muskulatur och stödjevävnader och det är möjligt att komplikationer från rörelseapparaten hos patienter med diabetes delvis kan bero på IGF-I brist. Kärlsystemet innehåller rikligt med IGF-I receptorer och låga IGF-I nivåer kan öka risken för kardiovaskulära komplikationer. I fortsatta studier undersöker vi den kliniska betydelsen av låga IGF-I nivåer vid diabetes och hur IGF-I kan normaliseras.

Mekanismer för insulinverkan och insulinresistens vid typ 2 diabetes

Peter Strålfors, professor, avdelningen för cellbiologi Fredrik H Nyström, universitetslektor, avdelningen för internmedicin Hälsouniversitetet, Linköping

Typ 2 diabetes
Det finns i Sverige omkring 300 000 patienter med diagnosticerad typ 2 diabetes och incidensen ökar. Runt om i världen, speciellt i de utvecklingsländer med en snabbt växande medelklass, som Indien och Kina, ökar incidensen lavinartat. Vid detta årtiondes slut tros en kvarts miljard människor lida av typ 2 diabetes. Den snabba ökningen beror huvudsakligen på att det är en välfärdssjukdom med en mycket stark koppling till fetma och ett stillasittande liv. Det är en kostsam sjukdom som innebär stort lidande, särskilt när komplikationer tillstöter. Läkemedelsföretagen satsar stora resurser, och det gör också icke-kommersiella forskningsfinansiärer, för att förbättra behandling och bot. Trots detta vet vi ännu inte i detalj hur insulin ökar glukosupptaget i muskler och fettvävnad, vi förstår heller inte sjukdomsutvecklingen till typ 2 diabetes. Men nya fynd markerar att vi nu börjar förstå de mekanismer som ger upphov till sjukdomens kardinalproblem - insulinresistensen.
Insulin produceras i och frisätts från beta-cellerna i pankreas som svar på att produkterna, främst glukos, från en måltid når ut i blodet. Som det viktigaste anabola hormonet stimulerar insulinet kroppens celler att ta upp och utnyttja näringsämnena till förbränning, nysyntes av cellmaterial och för upplagring i form av fett och glykogen. Vid typ 2 diabetes svarar målcellerna, främst fett, muskel- och leverceller sämre på insulinet. Denna insulinresistens maskeras under många år av beta-cellernas förmåga att frisätta ökade koncentrationer av insulin, vilket kompenserar insulinresistensen. När så småningom beta-cellernas insulinproduktion inte förmår täcka behoven och insulinresistensen kombineras med insulinbrist stiger glukosnivåerna och diabetessjukdomen kan diagnosticeras.

Figur 1. Insulinets signalöverföring från insulinreceptorn i cellmembranets caveolae-inbuktningar till olika cellprocesser. Insulinreceptorn signalerar direkt till tyrosin-fosforylering av IRS och indirekt till fosforylering av serin-307, som i sin tur förstärker tyrosin-fosforyleringen. Tyrosinfosforyleringen signalerar vidare till en rad av mer eller mindre kända proteiner, vilka i slutändan exempelvis ökar cellens glukosupptag och hämmar fettsyrafrisättningen. Vid insulinresistens och typ 2 diabetes är fosforyleringen av serin-307 satt ur spel och därmed förstärkningen av tyrosinfosforyleringen varför cellen blir insulinresistent.

Insulinets verkningsmekanism
Insulin kontrollerar sina målceller genom att binda till ett receptorprotein på cellytan. Insulinreceptorn aktiveras genom att den kopplar fosforsyra på specifika tyrosin-aminosyror i sin egen proteinkedja (ett exempel på den vanligaste process för hormonell kontroll vilken benämns fosforylering) och kan därigenom också fosforylera tyrosin i ett stort signalmedierande protein: IRS (insulinreceptorsubstrat) (Figur 1). IRS spelar en nyckelroll i insulinets signalöverföring i alla målceller. När IRS har fosforylerats på specifika tyrosiner i proteinet fungerar det som ett bindningsrelä dit olika signalproteiner kan binda och därigenom själva aktiveras för vidare signalering till olika delar och funktioner i målcellerna. På så sätt stimuleras t. ex. fett- och muskelceller till ökat upptag av glukos.
Vi fann för några år sedan att insulinreceptorn är lokaliserad till specifika inbuktningar i cellmembranet, till så kallade caveolae (små grottor) och att den är helt beroende av dessa för att fungera i signaleringen (Figur 2 och 3). Dessa caveolae har en hög koncentration av kolesterol. En av de viktigare funktionerna för kolesterol i celler är just att bygga upp caveolae. Vi har också visat att det insulinstimulerade upptaget av glukos sker i caveolae. Vi har nyligen publicerat resultat som demonstrerar att i caveolae sker också upptaget av fria fettsyror, vilka i caveolae omvandlas till de triglycerider som bygger upp fettcellernas stora fettlager. Även kolesterolomsättning har vi funnit i en specialiserad form av caveolae. Caveolaes roll för insulinets kontroll och för fettcellens centrala funktioner gör att mycket av vår forskning koncentreras kring dem.
I en pågående studie undersöker vi hur mRNA för större delen av genomet (ca 30 000 gener) i fettceller påverkas av den ökade insulinkänslighet som följer av behandling med den antidiabetiska medicinen rosiglitazon. Vi tar fettbiopsier på patienter med typ 2 diabetes före och efter två månaders behandling. På samma sätt undersöker vi också vilka gener som påverkas av minskad motion och ökat kaloriintag i fettväven. En mindre grupp vältränade individer slutar träna och äter mer mat än vanligt under en kortare period. Genom att sedan lägga ihop resultaten från förändringarna i genuttryck vid de båda interventionerna, kan vi kraftigt öka den statistiska styrkan i att hitta de viktigaste gener som styr insulinkänsligheten och som är involverade i uppkomst av insulinresistens i mänskliga fettceller.

Figur 2. Svepelektronmikroskopibilder av ytan på en intakt fettcell och av cellmembranets insida har använts för att skapa denna skalenliga bild av en fettcell. Cellmembranets insida är beströdd med caveolae-inbuktningar av olika storlekar.

Insulinresistensens mekanismer
Insulinresistensen vid typ 2 diabetes beror på att signalöverföringen i cellerna inte fungerar normalt. I sällsynta fall har detta visats bero på fel hos insulinreceptorn eller någon mutation som förstör funktionen hos nedströms liggande signalproteiner. När det gäller den stora massan av patienter med insulinresistens har defekten inte kunnat lokaliseras eller förklaras molekylärt, något som krävs för att på ett rationellt sätt kunna utveckla nya läkemedel och behandlingsstrategier. Ett av skälen till den begränsade förståelsen är att insulinets normala signaleringsvägar ännu inte är helt kända. En annan viktig anledning är att de allra flesta forskargrupper runt om i världen studerar cellodlingar eller använder djurmodeller istället för mänskliga celler från friska personer och från patienter. Cellodling och djur är mycket reproducerbara, nya gener för specifikt muterade proteiner kan introduceras både i celler och djur för att genom effekten av sådana manipuleringar förstå mekanismer. Detta är naturligtvis oerhört kraftfulla verktyg. Problemet är att man lätt glömmer att sådana experiment bara kan hypotesgenererande i förhållande till sjukdomar hos oss människor. Vår forskargrupp fokuserar på att arbeta med färskt isolerade celler från djur, men framför allt från människor. Genom ett mycket välfungerande samarbete med kvinnokliniken i Linköping har vi tillgång till fettväv, som tas i samband med kirurgiska ingrepp, fyra dagar i veckan. Vi har utvecklat unika metoder för att transfektera (inkorporera DNA) in muterade gener i mänskliga fettceller, vilket öppnat nya möjligheter för oss.
Vi har påvisat att fettceller från människa och från råtta uppvisar avsevärda skillnader i hur de reagerar på insulin. Medan isolerade råttfettceller blir okänsligare för insulin efter att ha hållts i odlingsmedium över en natt, så ökar insulinkänsligheten hos mänskliga fettceller under samma förhållanden. Detta beror på att de mänskliga fettcellerna får återhämta sig efter den insulinresistens som framkallas av stressen kopplad till det kirurgiska ingreppet att ta bort fettväv. Eftersom det är insulinresistensen kopplad till fetma och brist på motion som är av primärt intresse vid studier av det metabola syndromet och typ 2 diabetes, och inte stressinducerad insulinresistens, så utför vi våra försök på celler som vilat övernatt. Att konsekvent ta hänsyn till detta vid våra undersökningar ger de prekliniska försöken särskilt hög klinisk relevans för diabetes.

Insulinresistens vid typ 2 diabetes
beror på defekt fosforylering av ett signalprotein. Tidigare i år har vi publicerat en studie som visar att vid typ 2 diabetes är insulinreceptorns förmåga att fosforylera IRS nedsatt. Detta är inte förvånande eftersom IRS under senare år rönt allt mer intresse för sin förmåga att inte bara vidarebefordra utan också modifiera insulinsignaleringen. Man har således funnit att insulin stimulerar till fosforylering av IRS på aminosyran tyrosin för signalöverföringen, men också på ett stort antal serin-aminosyror. Fosforyleringen på serin medför vanligen att signaleringen hämmas som en del av en negativ feedback kontroll. Med våra fynd i bakhuvudet undersökte vi serinfosforyleringen av IRS hos fettceller från människa. Vi fann att fosforyleringen av en specifik serin - serin-307 - i IRS-proteinet ökade snabbt vid insulinstimulering av celler från "friska" icke-diabetiker men att denna specifika serine-307 fosforylering var utslagen i celler från patienter med typ 2 diabetes (Figur 1). Genom att artificiellt blockera den fosforyleringen fick vi fettceller från icke-diabetiker att bete sig som insulinresistenta celler från diabetiker. Och omvänt, genom att artificiellt öka fosforyleringen av serin-307 i insulinresistenta celler från diabetiker fick vi cellerna att svara normalt på insulin på samma sätt som celler från icke-diabetiker gör. Vi fann alltså att förutom den direkt signalmedierande tyrosinfosforyleringen så stimulerar insulin till en serinfosforylering av IRS, vilket förstärker signalen, och denna positiva feedback effekt är utslagen vid typ 2 diabetes.
Dessa fynd visar för första gången en molekylär mekanism för insulinresistensen vid typ 2 diabetes i primära fettceller. Celler från flera icke-selekterade grupper av diabetiker betedde sig utan undantag på samma sätt varför mekanismen tycks vara mycket generell. Vårt fortsatta arbete inriktas på att beskriva de molekylära interaktioner mellan cellens proteiner som sätter serin-307 fosforyleringen ur spel hos patienter med typ 2 diabetes.

Figur 3. Svepelektronmikroskopisk närbild av cellmembranets insida på en fettcell, med den tredimensionella strukturen av insulinreceptorn skalenligt inlagd i en caveola

Konklusion
Insulinets normala verkningsmekanismer och sjukliga förändringar som ger upphov till insulinresistens och typ 2 diabetes undersöks i fettceller från människan. Mycket återstår att ta reda på om hur insulin normalt fungerar och vid diabetes, men nya resultat från vår forskargrupp har identifierat ett specifikt signalprotein - IRS - och fosforyleringen på en specifik aminosyra - serin-307 - som kritisk för en effektiv insulineffekt. Vid typ 2 diabetes är denna fosforylering satt ur funktion varvid celler och vävnader blir insulinresistenta.

Forskning om IT-stöd för unga med diabetes

Sam Nordfeldt, läkare Avdelningen för pediatrik Hälsouniversitetet, Linköping

Bakgrund
Diabetesbehandling är till 95% egenvård i vardagen. Diabetesteamet har till stor del en medicinskt konsultativ, utbildande, motiverande och stödjande roll. Stöd från engagerad personal som ger individualiserad utbildning, tillgång till moderna insulinregimer och bra hjälpmedel betyder mycket. Men i det långa loppet är det patienter och familjer som behöver bli sina egna experter och själva styra behandlingen. Till det behövs både motivation och kunskap om stort och smått. Olika slags informationsresurser och forum för kommunikation med andra kan tänkas underlätta lärandet.

Internet och diabetes
Det finns idag många svenska webbsidor med information av särskilt intresse vid diabetes. Man hittar patientinformation, expertråd, matrecept och tips om kost och näring, riktlinjer för vården och mycket annat. Bakom informationen står enskilda personer, företag, myndigheter som Socialstyrelsen och Livsmedelsverket samt patientföreningar och forskningsfonder som Svenska Diabetesförbundet och Barndiabetesfonden. På de stora svenska sidorna har bl a diskussionsforum blivit populära. Det har dock varit sparsamt med forskning och utvärdering. För ungdomar finns mer än 100 svenska ungdomssidor med olika inriktningar. Olika forum för virtuell kontakt med andra finns som regel på dessa sidor. Den mest använda sidan Lunarstorm uppges ha 1,5 miljoner medlemmar - trots ett kanske måttligt inbjudande utseende. Idag rör sig ungdomarna snabbt mellan olika virtuella rum. Många sitter med flera fönster öppna och kanske chattar med kompisar samtidigt som de surfar runt, kanske lyssnar på musik och/eller laddar ned något intressant. Det går ofta snabbt att avgöra om en sida man besöker är av intresse eller om man surfar vidare.

Diabit-projektet
Inom det tvärvetenskapliga forskningsprojektet Diabit har målet varit att utveckla IT-stöd för ökat patientbemyndigande - empowerment - i kontakterna med hälso-och sjukvården (1). Fokus har varit mer på samspel människa-teknik än på tekniken i sig. Med diabetesungdomar och föräldrar som målgrupp har man arbetat med metodutveckling och tillämpning på diabetesområdet.

Baslinjemätningar på kliniken
Breda enkäter om upplevd vårdkvalitet och livskvalitet gav en bild av vad som upplevs som styrkor och svagheter i vården som den fungerar idag. Instrumentet KUPP, Kvalitet Ur Patientens Perspektiv erbjuder en tvådimensionell metod som tydliggör både hur vården upplevs på en viss punkt och hur betydelsefull just den delen av vården är. Genom att skapa specifika frågor om den typ av vård man bedriver kan man se t ex vad som tycks fungera mindre bra men upplevs viktigt. Här indikerades bl a att patientinformationen behöver utvecklas vidare på vissa punkter (2).

Forsknings- och designmetoder
Genom att samla patienter och föräldrar i s k användargrupper inhämtades en rad tidiga förslag och visioner om tänkbara resurser via internet. Genom att renodla synpunkter till s k kravspecifikationer kunde man utveckla s k prototyper, dvs tidiga versioner av system. I en återkommande process över lång tid kunde man återföra dessa till användare för att pröva och återigen få mer feedback, att ta med i det vidare arbetet. I förlängningen gjordes små pilotstudier där en liten grupp användare prövade en prototyp och lämnade synpunkter i s k fokusgrupper efteråt. Det visade sig snart att relativt få ungdomar och föräldrar kunde avsätta tid till att delta i upprepade gruppträffar. Som komplement prövades andra metoder. Att låta systemutvecklaren få en stund vid datorn med en ungdom vid ordinarie besök på mottagningen var enklare. Så skedde testkörningar och vidareutveckling av ett interaktivt simuleringsprogram. En tredje metod som har prövats i Diabit-projektet är Dokumentärväskan (3). Där lånar familjen hem diverse utrustning för självdokumentation och filmar, antecknar mm efter eget tycke. Sedan kan forskare ta del av materialet.

Diabit-portalen
Efter hand utvecklades en diabetesinriktad Internetportal, som ett komplement till övrig vård och patientutbildning. Här erbjuds bl a strukturerad patientinformation i text, bild och video, elektronisk kontakt med det egna diabetesteamet samt forum för kontakt med andra patienter och föräldrar. Patienter i grupper och barndiabetesteamen i Jönköping och Linköping har varit involverade i utformningen. Informationsinnehållet är förankrat i det egna diabetesteamets policy. Portalen prövas i en klinisk studie vid två barnkliniker under år 2006-08. Den är idag öppen för ca 200 slumpmässigt valda familjer via medlemslogin. I studien mäts användningen av de olika delarna och vilka effekter detta möjligen kan få på livskvalitet, upplevd vårdkvalitet och behandlingsresultat. Resultaten kan eventuellt bli av intresse vid utformning av diabetesteamens framtida sidor i landstingens patientportaler och liknande.

Linköping Complication Study - diabetesnefropati kan förebyggas
Johnny Ludvigsson, professor, avdelningen för pediatrik. Hans Arnqvist, professor, diabetesenheten och avdelningen för cellbiologi Hälsouniversitetet, Linköping

Diabetes medför på sikt vaskulära komplikationer (njurar, ögon, hjärta, stora kärl, nerver) och är vanligaste orsaken till svår njurskada liksom till blindhet bland yngre vuxna i västvärlden. Mortaliteten är kraftigt ökad. Randomiserade studier visar att god metabol kontroll och aktiv insulinbehandling kan motverka uppkomsten av komplikationer, men det saknas långtidsstudier av oselekterade populationer.
Linköping Complication Study är en uppföljning från debuten och framåt av alla i upptagningsområdet för Barn-och Ungdomsmedicinska kliniken i Linköping (centrala och västra Östergötland med ca 250 000 invånare) som fått diabetes före 15 års ålder. Studien påbörjades i formaliserad form 1974 under ledning av Yngve Larsson och innebar initialt en retrospektiv del i det att alla diabetesbarn med debut i upptagningsområde från 1960 inkluderades. Dessa patienter följs från 1975 prospektivt, liksom alla som debuterat därefter. Studien är en populationsbaserad, systematiserad uppföljning med försök till så noggrann registrering som möjligt av variabler som speglar metabol kontroll dvs tillväxt, pubertetsutveckling plus under 1970 talet fasteblodsocker, lipidstatus, glukosuri-index och från slutet av 1970-talet HbA1/HbA1c, blodsockerbestämningar i hemmet. Akuta komplikationer har registrerats och särskilt tecken på diabeteskomplikationer (mikroalbuminuri, BT, ögonbottenstatus med ögonbottenfoto, ledstatus, nervfunktion). Motsvarande undersökningar gjorda efter 20-årsåldern, sedan de lämnat Barn- och Ungdomsmedicinska kliniken i Linköping, registreras . Patienterna har fått enkäter rörande behandlingskvalité, journaler har gåtts igenom, och patienter som har flyttat från upptagningsområdet har uppsökts via andra sjukhus. Vetenskaplig analys är hittills gjord baserad på uppföljning av alla som insjuknat 1960-85. Fn koncentreras studierna på att försöka reda ut vilka faktorer som förklarar varför vi erhållit så kraftig reduktion av sena komplikationer, främst av njurskada, men efterhand också en signifikant reduktion av retinopati, inte minst betydelsen av kvarvarande insulinsekretion/c-peptid.

Uppmuntrande resultat
Linköpingsstudien första resultat ( N Engl J Med 1994:330:15-18) visade närmast sensationellt goda långtidsresultat vad gäller njurskada i en oselekterad patientpopulation. Vi kunde också visa att mikroalbuminuri inte alls, som ansetts tidigare, nödvändigtvis leder till allvarlig nefropati på sikt, utan i flertalet fall försvinner mikroalbuminuri när den metabola balansen förbättras. Senare uppföljning visar att den dramatiskt reducerade nefropatiförekomsten kvarstår efter >30 års duration, dvs det tycks inte vara fråga om uppskov av skadan utan snarare prevention. Retinopati , särskilt av lindrigare art, är vanligt förekommande, ofta redan tidigt under sjukdomen och till en början kunde vi inte påvisa någon minskning av allvarlig retinopati definierad som behov av laserbehandling. Pga av ändrade diagnostiska metoder och skärpta indikationer kan möjligen en minskning ha varit svårpåvisad, men trots detta finner vi vid senaste uppföljningen 2004 också en uttalad minskning av svår retinopati. Klinisk neuropati tycks gå att förebygga, men subklinisk neuropati i form av nedsatt nervledningshastighet förekommer i relativt hög frekvens och mycket god blodsockerbalans förefaller krävas för att förhindra detta. Även autonom neuropati är svår att helt förhindra.
Behovet av strikt metabol kontroll har ökat oron för svåra hypoglykemier. Vi har inte sett någon tydlig relation mellan frekvensen svår hypoglykemi och HbA1c utan snarare beror många allvarliga hypoglykemier på misstag som i viss mån via intensiv utbildning går att förhindra. Icke desto mindre får många diabetespatienter på sikt EEG-förändringar. Dessa är dock inte enbart associerade till tidigare allvarliga hypoglykemier utan också till alltför högt HbA1c. Med tanke på att HbA1c slår igenom som den helt dominerande prediktorn för sena komplikationer så visar Linköping Complication Study tydligt att aktiv diabetesbehandling lönar sig. Fortfarande återstår dock mycket att lära för att erhålla ännu betydligt bättre resultat. I en pågående regional studie VISS (vaskulära komplikationer i Sydöstra Sjukvårdsregionen) följer vi patienter med typ 1 diabetes som insjuknat i åldern 0-35år med HbA1c från debuten. Förutom HbA1c verkar åldern vid diabetsdebuten ha betydelse för retinopatiutveckling.

|Upp|