Harmonisering av HbA1c analyser i Sverige*

Jan-Olof Jeppsson, Göran Sundkvist och Gunnar Nordin

DCCT studien från 1993 visade tydligt att HbA1c är en viktig markör för att följa den metabola kontrollen vid behandling av typ 1 diabetes (1).

Risken för framförallt ögonkomplikationer var direkt relaterad till HbA1c koncentrationen hos den individuelle patienten. UKPDS studien från 1998 visade även det stora värdet av HbA1c bestämningar för att följa den metabola kontrollen vid typ 2 diabetes (2) .

Som en konsekvens av DCCT studiens resultat bildades ett speciellt certifieringsorgan i USA, National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP), som verkat sedan 1996 (3). Avsikten var att garantera samma framtida kvalitet av HbA1c analysen i USA som under DCCT studien. Våren 2002 använde 81 % av USA-laboratorierna NGSP certifierade metoder för HbA1c analys, vars resultat var jämförbara med DCCT studiens.

Olika organisationer i England, Frankrike, Holland, och Italien har successivt infört liknande kvalitetskrav och rekommendationer. Japan och Sverige använder sedan 1997 mera specifika jämförelsemetoder, som ger något lägre värden. Kvalitetskraven är större.

Som framhållits i många publikationer har det inte funnits någon vetenskapligt och internationellt accepterad världsstandard för HbA1c. Klinisk kemi i Malmö har deltagit i utvecklingen av en ny referensmetod, som godkändes i juli 2001 av International Federation for Clinical Chemistry Laboratory Medicin (IFCC) (4). Metoden kommer efter pågående validering att ersätta den äldre och ospecifika jämförelsemetoden, som användes av NGSP. Alla tillverkare av reagens och instrument för HbA1c (c:a 15 st.) har redan fått tillgång till dessa resultat från IFCC metoden. Företagen kommer initialt att förse sina kalibratorer med både IFCC och DCCT värden.

Åsatta värden på kalibratorer bestäms gemensamt av 10 certifierade laboratorier i Belgien, Holland, Italien, Tyskland, Sverige, Japan och USA. För den europeiska delen har ett större EU-anslag erhållits, som slutredovisats 2001 ( R&D Projekt CT 98:2248). Diskussion pågår nu inom olika internationella diabetesorganisationer om hur den nya referensmetoden kommer att påverka patientresultaten, som kommer att bli lägre än de nuvarande. Det kommer dock att finnas "masterekvationer" så att omräkning kan ske mellan de olika enheterna ( ex Mono S konvertering till IFCC). För Mono S innebär det en mindre sänkning och för DCCT en klart större tal eftersom kalibreringsmetoden för DCCT bestämmer ett antal komponenter, som inte representerar HbA1c.(5)

Initiativ i Sverige

Vid Diabetesforum i Linköping 1995 diskuterades möjligheter till förbättrade och jämförbara HbA1c analyser i Sverige. En pilotstudie genomfördes i sydöstra sjukvårdsområdet med centrum i Linköping för att testa en modell för nationell standardisering.

I detta arbete deltog förutom berörda kliniker och klinisk kemiska laboratorier även instrumentföretag och den svenska kvalitetssäkringsorganisationen för Laboratoriemedicin, SEQLA, sedermera EQUALIS, Uppsala. EOUALIS ägs av Landstingförbundet, Svenska Läkarsällskapet och Institutet för Biomedicinsk Laboratorievetenskap .

En konsensus med kvalitetskrav och handlingsprogram undertecknades i mars 1997 av fem sektioner inom Svenska Läkarsällskapet, Svensk Förening för Sjuksköterskor i Diabetesvård samt Svenska Diabetesförbundet (6). I slutet av 1997 genomfördes en första kalibrering med ett gemensamt material med kända HbA1c koncentrationer baserat på medelvärdet från fem Mono S referenslaboratorier i Sverige (7,8).

Mono S är ett fabriksnamn på ett kromatografi-material från Amersham Biosciences, tidigare Pharmacia Biotechnology i Uppsala. Metoden har varit i bruk sedan mitten av 80-talet och separerar HbA1c från övriga Hb fraktioner med stor reproducerbarhet.

Efter det att HbA1c-analyserna kraftigt ökat i antal har Mono S metoden successivt ersatts med nya utrustningar med högre kapacitet, men med samma analysprincip och reproducerbarhet. De viktigaste målen i konsensusdokumentet och genomförda åtgärder

Framlidne docent Kristoffer Hellsing var, som initiativtagare till SEQLA och senare VD för EQUALIS, starkt engagerad i detta projekt

Omslagsbild: Schematisk bild av hemoglobinmolekylen med olika bindningsställen för glukos. b- och a-kedjor är markerade i gult respektive blått. De röda strukturerna avser möjliga bindningsställen för glukos. Den cyanfärgade delen är den peptid som isoleras och bestämmes med och utan glukos i IFCC referensmetoden. Den innehåller den aminosyra, som har störst affinitet för glukos. De gröna strukturerna kan binda glukos vid mycket höga blodsockernivåer.

Variation inom ett laboratorium. Variationen inom ett och samma laboratorium över tiden (slumpfelet, summan av inom-dag och mellan-dag variationen) skall vara < 3 % bestämt som variationskoefficient (CV). Dessa resultat finns tillgängliga på alla sjukhuslaboratorier och ackrediterade vårdcentraler. HPLC metoderna på sjukhusen uppfyller dessa ursprungliga krav. Ett välskött individuellt instrument uppvisar ofta ett CV på 1,5 ­ 2 %. De immunologiska metoderna har större variation.

Variation mellan laboratorier i landet. Variationen mellan olika laboratorier vid ett och samma tillfälle för det provmaterial som EQUALIS skickar ut, vanligtvis en gång per månad, skall vara < 3 % (CV). Mellanlaboratorie-jämförelser finns dokumenterad hos EQUALIS sedan 1994. Av figur 1 framgår att endast sjukhusmetoderna uppfyllt kraven på CV<3 % under senare år. En markant förbättring har skett av primärvårdens harmonisering efter kalibreringen i slutet av 1997. Flera medarbetare inom från EQUALIS har också deltagit i olika fortbildningsprogram sedan början av 90-talet.

Fabrikanterna, som säljer patientnära utrustningar har under tiden deltagit i internationella IFCC jämförelser och därmed gjort vissa justeringar till det bättre.

Fig 1: Mellanlaboratorievariation (CV%) för det material, som EQUALIS skickat ut 1994-2001 till sjukhus och primärvård/motsvarande. Pilen anger tidpunkten för Mono S kalibrering. Den streckade linjen önskvärd maximal variation motsvarande 3 % (CV)

Tabell 1 visar medelvariationen som %CV per metod och år. Sjukhuslaboratorier har analyserat sitt prov i triplikat och beräknat ett medelvärde medan primärvårdslaboratorier av kostnadsskäl endast analyserat ett enkelprov. Det utsända materialet har bestått av poolat EDTA blod med olika HbA1c nivåer, som skickats en gång per månad till c:a 40 sjukhuslaboratorier och c:a 240 primärvårdslaboratorier eller motsvarande. Endast HPLC gruppen uppfyller de ursprungliga kvalitetskraven för mellanlaboratorieprecision, vilket internationellt sett är mycket bra med tanke på att den representerar åtminstone 4 olika typer av analyssystem.

Tabell 1: Medelvariation (CV%) per år för fem olika analysmetoder under åren 1994-2001.Den stora variationen kring 1997 sammanhänger med då pågående omkalibreringar.

Av primärvårdsmetoderna visar Bayer DCA 2000 de bästa resultaten. Dessa är i allmänhet beroende av fabrikantens förmåga att bibehålla en stabil kalibrering över tiden. Metoder kan vara olika robusta, vilket innebär känslighet för små förändringar i handhavandet eller kritiska moment i själva analysen. Behandling av provmaterialet från EQUALIS är också av betydelse. En annan viktig faktor är personalens utbildning och erfarenhet av den aktuella utrustningen.

Mono S kalibrering

Överenskommelsen om harmonisering innebar att alla HbA1c metoder i Sverige skall kalibreras mot Mono S metoden med hjälp av fem Mono S laboratorier, som dokumenterat en hög analyskvalitet. Detta har skett 1997, 1999 och 2001 för HPLC och immunologiska me-

toder vid sjukhusen. Även tre företag, som marknadsför patientnära

metoder har kalibrerat sina metoder till svensk Mono S standard. Därmed skulle alla resultat bli jämförbara inom landet.

USA jämförelse

Jämförelse skall ske minst en gång årligen med den amerikanska certi-

fieringsenheten, NGSP. Detta har skett inom IFCC nätverket med 10 pooler innehållande färskt EDTA blod från patienter med olika HbA1c koncentrationer. En av den internationella arbetsgruppen godkänd ekvation, baserad på de tre sista årens jämförelser, är under publicering (9)

Nytt referensintervall

Ett referensintervall för icke-diabetiker skall tas fram. För detta utnyttjades ett material från Kristianstad, där 244 individer läkarundersöktes och intervjuades om läkemedel samt kända sjukdomar. Hos deltagare, lika fördelade mellan könen och i åldrarna 20-80 år och med normalt fP-Glukos , analyserades HbA1c med Mono S metoden i duplikat. För åldersgruppen 20-50 år blev referensintervallet för HbA1c, 3,6-5.0 % och för gruppen > 51 år, 4,0-5,3 % (medelvärde +/- 2SD) (10). Det fanns ingen könsskillnad.

HbA1c avvikelse för olika län i Sverige

Kartor togs fram för att undersöka om det fanns regionala skillnader i HbA1c nivåer. Grunddata består av samtliga resultat från sjukhuslaboratorier och primärvård som rapporterats till EQUALIS under åren 1995, 1997, 1999 och 2001. Den genomsnittliga avvikelsen från HPLC gruppens medelvärde, vilket antas vara det sanna värdet, illustreras med olika färgnyanser för varje län. Den mörkaste nyansen har län som i genomsnitt för året rapporterar 0,6 HbA1c %-enheter högre värde än HPLC medelvärdet.

De län som rapporterar 0,6 HbA1c %-enheter under HPLC värdet har ljusare färg. Län med mycket få rapporterade resultat har grå färg. De län som tenderar att av vika mest i färgnyans är de som använder en mätteknik, som skiljer sig från HPLC-nivån. Observera att resultaten inte säkert är representativa för samtliga patientvärden från respektive län. Resultaten illustrerar ändå förhållandet, att i områden med en teknik som avviker från HPLC, har den genomsnittliga avvikelsen för HbA1c-resultaten varit betydande.

Fig 2: Medelavvikelse för HbA1c uppdelat per län under 4 år.

Betydelsen av grafiska patientsvar

För att använda HbA1c i ett mer patientnära perspektiv har vi i Malmö utvecklat en filterpappermetod där patienten själv tar ett kapillärblodprov som appliceras på ett speciellt filterpapper (11). Detta papper sänds sedan till det kemiska laboratoriet för HbA1c bestämning. Svaret sänds sedan ut direkt till patienten i form av en grafisk presentation (figur 3).

Det absoluta värdet visas också i en tabell. Metoden har blivit mycket uppskattad av våra patienter och har i många fall medfört en förbättrad metabolisk kontroll. Vid intensifierad behandling brukar vi föreslå en test per månad. När resultaten förbättrats och stabiliserats föreslås en kontroll varannan till var tredje månad. Metoden har också inneburit att antalet mottagningsbesök för den välreglerade patienten med bra HbA1c värden har reducerats.

Fig 3. Exempel på grafisk presentation till patienter med aktuellt och historiska resultat. Patient med dåligt reglerad typ 2 diabetes (tablettbehandlad) med påtagliga allmänsymtom. I samband med vistelse på Dagvårdsavdelningen insätts insulin (månad 4) varefter patienten blir avsevärt förbättrad ur metabol synpunkt och därtill försvinner patientens sjukdomssymtom helt.

Förbättrad resultat-redovisning

Varje laboratorieenhet bör själv registrera internkontrollresultat per dag eller vecka beroende på analysfrekvens för att kunna beräkna en variationskoefficient för en lämplig tidsperiod. Denna beräkning av slumpfelet inom ett laboratorium sker automatiskt på sjukhuslaboratorier.

Kvalitetskravet i konsensusdokumentet från 1997 fokuserade på analysvariationen, och angav inte exakt vilken genomsnittlig avvikelse från det sanna (dvs HPLC-medelvärdet) värdet som var acceptabelt för ett enskilt laboratorium. Det finns anledning att överväga att införa en sådan precisering i kvalitetskraven, för att därigenom närma sig en målsättning för maximal mätosäkerhet i ett HbA1c resultat, dvs hur långt ifrån "ett sannt" HbA1c värde som ett rapporterat patientresultat ska få vara (12). EQUALIS kommer fr.o.m. senhösten 2002 att redovisa avvikelsen för varje laboratorieenhet jämfört med medelvärdet för de fem Mono S referenslaboratorierna (figur 4).

Fig 4: förslag till rapport från EQUALIS till enskild laboratorium för att illustrera avvikelsen från HPLC medelvärdet i Sverige.

Dessa uppgifter ger en tydligare information om aktuell utrustning är samkalibrerad med övriga Sverige.

Den svenska ackrediteringsmyndigheten, SWEDAC, fäster stor vikt vid dessa resultat vid sin årliga tillsyn. Socialstyrelsen rekommenderade redan 1999, att varje enhet som utför HbA1c analyser, skall vara anslutet till ett externt kvalitetssäkringssystem. Figur 5 a-e visar den genomsnittliga avvikelsen från HPLC-medelvärdet under år 2001 för deltagare med två olika metoder för sjukhuslaboratorier och tre fabrikskalibrerade utrusningar för vårdcentraler eller motsvarande. Sjukhusmetoderna (HPLC och de immunologiska metoderna) visar med något undantag en maximal genomsnittsavvikelse på +/- 0,2 %-enheter HbA1c. Liknande resultat visar Bayer DCA 2000. De två övriga metoderna visar stora, icke acceptabla avvikelser Företagen måste fr.o.m. slutet av 2003 anpassa sig till IVD (in vitro diagnostik)

direktiven på den Europeiska marknaden (13).Detta innebär bl.a. att spårbarhet för de värden som angivits för kalibratorer och/eller kontrollmaterial skall säkerställas med hjälp av befintliga referensmätmetoder och/eller tillgängligt referensmaterial i en högre ordning d.v.s. i detta fall den nya IFCC referensmetoden för HbA1c.

Sammanfattning

Vi har visat att det går att harmonisera HbA1c analyserna i Sverige genom ett aktivt samarbete mellan sjukhus, vårdcentraler och företag som marknadsför HbA1c produkter. Företagens egen kvalitetssäkring av reagenser och metodens robusthet är av stor betydelse för att erhålla acceptabla resultat.

Den nya internationella referensmetoden från IFCC medför att spårbarheten för HbA1c kalibratorer blir densamma för alla tillverkare i hela världen, vilket kommer att återspeglas i högre kvalitet av HbA1c analysen i den praktiska verksamheten.

Målet att alla ska svara i samma HbA1c värden ligger längre fram då omräkningsfaktorer är validerade. Diskussioner har startat hur den värdefulla kliniska informationen från DCCT och UKPDS studierna bäst ska kunna konverteras till de lägre IFCC nivåerna.

5 a-e. Avvikelsen av HbA1c frånHPLC medelvärdet för fem olika analysmetoder.

Referenser

1. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med 1993;329:977-88.

2. Stratton IM, Adler AI, Neil HA, Matthews DR, Manley SE, Cull CA, Hadden D, Turner RC, Holman RR . Association of glycaemia with macrovascular and microvascular complications of type 2 diabetes (UKPDS 35): prospective observational study. BMJ 2000;321:405-11.

3. Little RR, Rohlfing CL, Wiedmeyer HM, Myers GL, Sacks DB, Goldstein DE. The National Glycohemoglobin Standardization Program: A Five-Year Progress Report. Clin Chem 2001; 47: 1985-92.

4. Jeppsson J-O, Kobold U, Barr J, Finke A, Hoelzel W, Hoshino T, Miedema K, Mauri P, Mosca A, Paroni R, Thienpont L, Umemoto M, Weykamp CW. Approved IFCC reference method for the measurement of HbA1c in human blood. Clin Chem Lab Med 2002; 40: 78-89.

5. Goldstein DE, Little RR, England JD, Wiedmeyer HM, McKenzie EM. Methods for quantitating glycosylated hemoglobins: high performance liquid chromatography and thiobarbituric acid colorometry: In Clarke WL, Larner, Pohl Sl eds. Methods in diabetic research. Vol. 2. Clinical Methods. New York: John Wiley, 1986: 475-504.

6. Arnqvist H, Wallensteen M, Jeppsson JO. Standard spikad för långtidsmått på blodsocker. Läkartidningen 1997;50:4789-90.

7. Jeppsson JO, Jerntorp P, Sundkvist G, Englund H, Nylund V. Measurement of Hemoglobin A1c by a New Liquid Chromatographic Assay: Methodology, Clinical Utility and Relation to Glucose Tolerance Evaluated. Clin Chem 1986;32:1867-72.

8. Eckerbom S, Berquist Y, Jeppsson JO. Improved method for analysis of glycated hemoglobin by ion exchange chromatography. Ann Clin Biochem 1994;31:355-360.

9. Hoelzel W, Weykamp C, Jeppsson JO, Miedema K , Barr J, Hoshino T et al. On behalf of the IFCC Working Group on HbA1c Standardization. The IFCC Reference System for the Measurement of HbA1c in Human Blood and the National Standardization Schemes in the USA, Japan and Sweden ­ a Method Comparison Study. (submitted for publication)

10. Bäck SE, Nilsson JE, Fex G, Jeppsson JO, Rosen U, Tryding N, von Schenck H, Norlund L. Towards Common Reference Intervals in Clinical Chemistry. Clin Chem Lab Med 1999;37:573-592.

11. Jeppsson JO, Jerntorp P, Almér L, Persson LO, Ekberg G, Sundkvist G. Capillary blood on filterpaper for Determination of HbA1c by Ion Exchange Chromatography. Diabetes Care 1996; 19:142-45.

12. Skeie S, Thue G, Sandberg S, Interpretation of HbA1c values among Diabetic Patients: Implications for Quality Specifications for HbA1c. Clin Chem 2001;47:1212-1217.

13. EDMA. Position Paper on General Aspects of Medial and Metrological Traceability in Laboratory Medicine.(2001).www.edma-ivd.be

Jan-Olof Jeppsson

Docent, f.d. Överläkare
Klinisk Kemi, Malmö,
jan-olof.jeppsson@klkemi.mas.lu.se

Göran Sundkvist

Professor,Överläkare
Endokrinologiska klinken, Malmö.
goran.sundkvist@endo.mas.lu.se

Gunnar Nordin, VD

EQUALIS, Uppsala,
Gunnar.Nordin@equalis.se